黏蛋白是调节新冠病毒感染的宿主因子

撰文

望夜

#BioArt新冠专题#

不断出现的新变异毒株提示我们新冠疫情仍在全球大范围流行，病毒的认识之旅仍在路上。对病毒宿主因子的认识，有助于理解病毒-宿主互作及新冠疾病。

年7月25日，加州大学伯克利分校EvaHarris、PatrickD.Hsu与斯坦福大学医学院SilvanaKonermann领导的研究团队在NatureGenetics合作发表题为Genome-widebidirectionalCRISPRscreensidentifymucinsashostfactorsmodulatingSARS-CoV-2infection的研究长文，通过基因组水平的CRISPR敲除和激活筛选，发现高度相互关联的原病毒和抗病毒因子宿主通路，涉及网格蛋白运输、炎性信号、细胞周期调节、转录和表观调节。此外还发现黏蛋白（mucin）是一种重要的宿主限制因子，可在体外和小鼠水平抑制病毒感染，还可抑制多种呼吸道病毒的感染。

众所周知，新冠病毒利用宿主细胞表面的血管紧张素转换酶II（ACE2）受体感染。为有效入侵宿主，病毒囊膜上的S蛋白需要经过宿主表面跨膜丝氨酸蛋白酶2（TMPRSS2）的切割；或当TMPRSS2缺失时，在内吞过程中会被溶酶体中的组织蛋白酶（CTSL）酶切。在肺上皮细胞中，由TMPRSS2介导的细胞表面入侵占主，因此抑制TMRPSS2可有效防止新冠病毒入侵肺上皮细胞。新冠在人体感染的大部分细胞都同时表达ACE2和TMPRSS2，如下呼吸道、上呼吸道、鼻腔和肠道的上皮细胞。

病毒感染周期涉及多种宿主因子的作用，它们或者发挥正向调节作用，或者发挥负调节作用。近期，通过功能缺失（loss-of-function，LOF）实验已发现一系列宿主因子，但这些研究要么是在非上皮细胞系中进行，要么是在缺乏ACE2和TMPRSS2表达的细胞中进行的。而且，功能缺失实验发现的往往是原病毒相关宿主因子，功能获得（gain-of-function，GOF）实验则可发现抗病毒因子，即介导病毒限制的基因。因此，采用双向筛选策略，可以同时发现病毒依赖的和潜在抗病毒的宿主因子。在本研究中作者选择使用一种人源肺细胞Calu-3细胞株，其可内源性表达ACE2和TMPRSS2。

发现原病毒和抗病毒宿主因子

作者首先进行LOF和GOFCRISPR筛选（图1），使用的是前述Calu-3细胞，它极易被新冠病毒感染并出现细胞病变（CPE）。LOF和GOF筛选均采用3-4个生物学重复，并保证超过×向导RNA（sgRNA）覆盖。病毒感染5天后，当细胞出现70%以上CPE时，收获细胞、提取基因组DNA，使用二代测序检测sgRNA靶向的富集或删除基因。LOF-富集到的、GOF-删除的是原病毒相关基因，而GOF-富集到的是抗病毒相关基因。两组分析中得分最高的基因均为ACE2，TMPRSS2在LOF筛选中也被高度富集。此外，LOF富集分析中的高分基因还包括AP1G1（编码一种网格蛋白适配体）、CHUK（编码NF-κB信号途径中的IKK-alpha）；在GOF-删除筛选到的是NFE2（编码一种转录因子）、TRAF3IP2（编码一种E3泛素连接酶）。在抗病毒基因方面，GOF筛选鉴定出TEAD3（编码一种参与调节细胞增殖的转录因子）、CCNE1（编码细胞周期素E1，是G1/S期转变必需的）、ZNF（编码一种锌指蛋白，可能参与转录调节）为得分最高的三个基因。综上，病毒入侵和转运因子、促炎症反应和细胞增殖调节相关组分是决定新冠病毒介导的Calu-3细胞死亡的关键决定因素。

图1本文的双向筛选策略示意图

宿主依赖的通路和互作网络

接下来，作者着重对两组筛选中得分前位的基因进行分析。首先进行蛋白互作网络分析，确定可能的相互作用并将其归类。其次，使用基因集合富集分析确认富集到的通路。作者发现，凋亡通路直接参与病毒介导的CPE形成，而经典的干扰素通路可通过调节细胞增殖或死亡通路影响CPE。此外，NF-κB介导的炎症通路、细胞连接复合物、细胞骨架重塑、适配体介导的网格蛋白运输和细胞周期调节等通路均被富集到。

为确定特定基因对新冠病毒感染的影响，作者分别构建出LOF富集和GOF删除后得分前5的基因敲除细胞株，并进行病毒感染，发现当ACE2、TMPRSS2、AP1G1、CHUK、ROCK1、RIPK4、TAOK2基因被破坏时，产生的可感染性病毒减少。其中，RIPK4和CHUK属于NF-κB通路，说明该通路的某些组分有助于病毒感染，并可能被病毒正向调节以促进其复制。为确定GOF删除结果，作者使用慢病毒介导的CRISPR激活组分确认上调ACE2、NFE2、TRAF3IP2、TRDMT1可不同程度增加病毒感染。此外，可增加病毒感染的基因还包括MEX3B、APOL1和CDKN2B，其中CDKN2B编码细胞周期蛋白依赖的激酶抑制剂2B，控制着G1期向S期的进展；APOL1编码网格蛋白适配体复合物AP1的亚基，作者推测其为病毒入侵过程必需，因为网格蛋白介导的内吞作用是病毒入侵途径之一。假病毒入侵实验也证实该推论。

肺上皮细胞中的独特依赖组分

作者接下来比较LOF筛选结果与近期发表的其它新冠LOF筛选结果，发现筛选到的共有基因在前种中不超过4种。作者发现感染病毒所用的细胞类型决定了筛选结果。尤其前述AP1网格蛋白适配体组分仅出现在本研究及近期一项同样在Calu-3细胞中进行的筛选中，这种差异凸显CTSL-和TMPRSS2-依赖的入侵和转运途径的差异。因此，在新冠病毒经TMPRSS2途径入侵过程中，调节内吞体成熟和CTSL功能的宿主因子可能是非必需的。

为分析本研究筛选到的基因的生理相关性，作者比较了最近发表的两项scRNA-seq研究结果，一项来自新冠肺炎病人支气管肺泡灌洗液的数据集，另一项来自健康人肺细胞的综合分析。作者发现新冠肺炎病人的肺上皮细胞表达谱与健康人不同，将前述个高得分基因与其比较，发现它们大多在新冠病体内表达水平也比较高，尤其是炎症相关（B2M、TAOK1）和细胞增殖相关（ELF3、TPT1、NUPR1）基因。随后，作者聚焦在共表达ACE2和TMPRSS2的纤毛上皮细胞的RNA-seq数据，这种细胞被认为是新冠病毒感染人体的首要靶细胞。作者再次发现与之前Calu-3中分析结果的吻合，说明Calu-3细胞更能代表生理条件下人体肺部同时表达ACE2和TMPRSS2的细胞。这里，重合的基因包括调节细胞增殖和迁移的（TMC5、ST14、KLF5）及细胞粘附的（CDH1）。最后，对照健康人与新冠病人支气管肺泡灌洗液数据，作者发现在Calu-3中高得分的基因正是病毒感染上皮细胞后表达调节最高的。总之，宿主因子是细胞类型特异性的，TMPRSS2表达与否决定了病毒通过哪条通路感染，Calu-3细胞中富集到的基因更能代表生理条件下人体肺上皮细胞的情况。

新冠病毒的宿主限制因子

GOF筛选可以提供宿主抗病毒因子的系统分析，即过表达可以限制病毒复制的基因。作者通过通路和蛋白互作网络富集分析发现，炎症通路、G蛋白偶连受体（GPCR）通路、转录调节、细胞周期调节和黏蛋白是关键抗病毒通路。作者选择GOF中得分最高的5个基因及上述通路中的代表基因，包括编码G1-S期检查点调节子CCNE1、多种转录调节子（TEAD3、ZNF、SPDEF、JDP2、TAF7L、ZNF、MRGBP）、宿主解旋酶（DDX28）、离子通道（TMEM、SLC44A2）、细胞连接调节子（DOCK4）及膜结合蛋白（CPNE3）。分别对这些基因的Calu-3过表达细胞株进行病毒感染实验，病毒滴度出现下降，表明上述基因存在抗病毒作用，但过表达ZNF不会影响病毒载量。

CCNE1编码的是促进细胞进入S期的蛋白，其作用与前述CDKN2B一致，后者编码细胞周期抑制剂，其上调会增加病毒复制。通过调整周期蛋白与CDK互作来调节细胞周期的方式在其他冠状病毒中也曾有报道。TEAD3和JDP2可能也通过调节细胞增殖对病毒起关键作用。转录因子SPDEF对杯状细胞的分化十分关键，后者参与粘液分泌。其余如DDX28已被证明与新冠N蛋白存在互作，CPNE3曾报道与SARSnsp1和RNA存在互作，IRP5是干扰素途径中的抗病毒蛋白。

黏蛋白是一类带有高度O-糖基化修饰的高分子量蛋白，是肺部和肠道上皮束粘液内壁的主要组分。在GOF富集分析中，膜锚定黏蛋白（MUC1、MUC4、MUC13、MUC21）形成一个庞大且相互连接的网络。此外，乙酰氨基葡萄糖转移酶（B3GNT6）及细胞表面蛋白CD44和ICAM1也出现在筛选结果中。由于定位于肺部、在抗病毒通路中被富集、此前未被报道，作者将